虾青素对骨关节炎软骨细胞氧化损伤及炎性的影响

12/06/2025 11:09:32

虾青素对骨关节炎软骨细胞氧化损伤及炎性的影响

骨关节炎(OA)表现为关节软骨完整性受损，软骨下骨板及关节边缘骨病变，即关节软骨的退变和继发性骨质增生。虾青素(Astaxanthin)，全称为3，3-二羟基-β胡萝卜素-4，4-酮，是一种含氧的类胡萝卜素，其分子结构的碳骨架由中央多聚烯链和位于两侧的芳香环组成，并在每个芳香环上各有一个酮基(=O)和一个羟基(-OH)。由于其有极强的抗氧化能力，具有抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力、抗癌、抗骨质疏松等多种生物学活性

1、材料与方法

1.1改善营养不良

1.1材料与试剂15只5月龄新西兰兔，体重(300±25)g，雌雄各半，由军事医学科学院动物实验中心提供(动物合格证号:JXYX-D20110720)。活性氧(ROS)检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱这氧化物酶(GSHPx)检测试剂盒均为南京建成生物工程公司产品;白介素(IL)-β、肿瘤坏死因子(TNF)-α放免试剂盒为解放军总医院放免所产品；低熔点琼脂为Sigma公司产品;总RNA提取试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;虾青素(纯度≥95%)由中央民族大学国家民委-教育部重点实验室药化室提供。

1.2 动物分组及动物模型建立

分为正常对照组、模型组、虾青素低剂量组、虾青素中剂量组、虾青素高剂量组，每组3只。兔OA动物模型的建立采用内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板改良Hulth法。造模组动物用水合氯醛(10%，1ml/kg)麻醉，仰卧位，四肢固定于自制手术台上，脱毛，碘伏消毒，铺无菌洞巾，取双后膝关节内侧横向切口约1.5cm，逐层打开关节腔，切断内侧副韧带，探查关节腔无原发病变后，切断前交叉韧带，全部切除内侧半月板造模，逐层缝合切口。假手术组动物操作同前，但不切断前交叉韧带和内侧半月板。术后每天肌注青霉素20万U，共1w，预防感染。术后采用一笼一兔喂养，造模1w后每日驱赶兔子来回行走约0.5h。每周制作一组模型，连续8w。从第9周开始，每周处死一组动物，分离培养软骨细胞，测定相关指标，连续8w。正常对照组由假手术动物分离获得，10%IMDM培养液培养;OA模型分4组，由造模动物分离获得，模型组10%IMDM正常培养;虾青素低剂量组加入10μg/ml虾青素，中剂量组加入20μg/ml虾青素，高剂量组加入30μg/ml虾青素。虾青素用含10%血清IMDM培养基配制成1mg/ml的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤无菌后，逐渐稀释得到30、20、10μg/ml的药液。

1.3观测指标与方法

1.3.1软骨细胞提取与培养

将新西兰兔固定，空气栓塞处死，剥皮暴露膝关节。截取膝关节，粗略修剪后浸入无菌DHank液体中，带入超净工作台，手术刀片取关节表面软骨，放入10ml无菌玻璃平皿，倒入D-Hank液掩盖标本。软骨切碎约为1mm×1mm的小块，D-Hank漂洗软骨小块3次，放入至10cm×10cmIMDM培养液瓶中。移入离心筒中，1400r/min离心5min。收集全部切碎软骨，加入0.25%胰酶(含0.04%EDTA)，37℃消化30min。吸出胰酶，加入4ml0.2%Ⅱ型胶原酶，置CO2培养箱中37℃消化4h，每0.5h取出振摇3min。收集上清液，1400r/min离心10min，弃上清，悬浮细胞于16mlIMDM培养液中，200目过滤至一新无菌离心管中。5×104接种于培养瓶中，置CO2培养箱中37℃培养。

1.3.2软骨细胞中ROS的测定

按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，控制细胞浓度在(1～20)×106/ml，37℃，20min。每隔3～5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。无血清培养液洗3次，充分去除未进入细胞内的DCFHDA。PBS重悬，流式细胞仪488nm光激发，检测525nm发射光强度，计数10000个细胞，以检测细胞内平均荧光强度反映ROS水平。

1.3.3细胞培养上清中NO、SOD和GSH-Px含量的测定

分离获取软骨细胞并分组，按5×104/ml，每孔0.5ml接种于24孔板，每组6个复孔，培养60h待细胞贴壁后，依据分组更换正常培养液或含不同浓度AHF的培养液，继续培养48h，收集细胞培养上清，5000r/min，离心10min，取上清－20℃冻存待测。NO检测:鉴于NO性质极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐，因此测定标本中亚硝酸盐和硝酸盐浓度可以作为衡量NO水平的指标。检测采用经典Griess法，操作按照说明书进行。SOD和GSH-Px检测按照说明书进行。

1.3.4细胞相关炎性因子表达的检测

细胞培养3d后，提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板，PCR扩增各目的基因，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物序列如下:

p53(444bp)上游:5'-ACAGAAACACCTTCCGACAC-3'，下游:5'-CCTGGGCATCCTTTAGCT-3';

IL-1β(474bp)上游:5'-TGCTGTCCAGACGAGGGCAT-3'，下游:5'-ACTCTCCAGCTGCAGGGTAG-3';

iNOS(465bp)上游:5'-CATGAAGTACATGCAGAGCG-3'，下游:5'-GCAAGGCGCAGCTGAACAAG-3';

GAPDH(618bp)上游:5'-GAGCCAAAAGGGTCATCATC-3，下游:5'-TGTGGCCAAATTCGTTGTCA-3'。

1.4统计学分析

应用统计学软件SAS10.0进行分析，数据以X̄±s表示，采用重复测量方差分析和成组方差分析。

2、结果

2.1软骨细胞中ROS水平的变化与对照组比较，模型组ROS水平明显升高(P＜0.01)，说明OA软骨细胞中确实存在氧化损伤。与模型组比较，虾青素低、中、高剂量组可使ROS水平显著降低(P＜0.01);说明加入不同剂量的虾青素后，降低了OA软骨细胞中ROS的水平。
2.2软骨细胞培养上清中NO、SOD和GSH-Px水平变化与对照组相比，模型组NaNO2含量明显升高(P＜0.01)，而SOD活性、GSH-Px活性明显降低(P＜0.01)。与模型组比较，虾青素低、中、高剂量组可显著降低NaNO2含量，显著升高SOD活性、GSH-Px活性(均P＜0.01)。见表1。

2.3软骨细胞相关炎性因子表达的影响与对照组相比，模型组IL-1β、iNOS和p53基因mRNA的表达显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，虾青素低、中、高剂量组可显著升高IL-1β、iNOS和p53基因mRNA的表达量(P＜0.01)。

3、讨论

所谓ROS，是指机体内或者自然环境中由氧组成、含氧并且性质活泼的物质总称，主要有一种激发态的氧分子，即重态氧分子或称单线态氧分子。常见的两种含氧的自由基分别为超氧阴离子自由基、羟自由基;三种过氧化物，分别为过氧化氢和过氧化脂质以及一种含氮的氧化物。ROS以其高反应性在生命活动中扮演了重要的角色，是近年来软骨细胞信号转导领域研究的热点〔3〕。本研究说明OA软骨细胞存在着氧化损伤。虾青素对OA的治疗作用可能是通过抗氧化损伤机制实现的。

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IL-1β表达增高对软骨损伤和退化具有重要作用，其能通过蛋白激酶MAPK激活核转录因子-κB(NF-κB)等信号通路，刺激MMP-1大量表达，引起软骨更为强烈的吸收〔4〕。发生OA的关节软骨细胞iNOS表达增高。iNOS催化精氨酸与氧分子的反应，形成一氧化氮，与抑制软骨细胞蛋白聚糖合成和诱导软骨细胞凋亡过程有关〔5〕。OA病变的软骨组织出现凋亡细胞明显增加，且与OA病情分级呈正相关〔6〕。p53是一种重要的细胞周期调节因子，在细胞凋亡过程中起关键作用。

本实验结果显示，剂量为10～30μg/ml的虾青素能抑制软骨细胞IL-1β、iNOS、p53的表达，大大降低炎性反应的发生，延缓细胞凋亡进程。综上所述，本实验初步证实虾青素对OA软骨细胞具有一定的生长调节作用，可有效降低软骨细胞因氧化而造成的损伤，减缓细胞凋亡速度，提高细胞抗炎能力，从而达到治疗OA的目的，但其作用机制尚需进一步探讨。